颈脊髓挫伤大鼠模型

由于外界直接或间接因素导致颈椎骨折，游离骨块撞击脊髓引起损伤，在损害的相应节段出现各种运动、感觉和括约肌功能障碍，肌张力异常及病理反射等的相应改变。

临床症状主要有：一、运动功能障碍，如四肢瘫痪、双下肢瘫痪等；二、感觉功能障碍，如损伤平面以下，感觉减退或感觉消失；三、自主神经反射紊乱，如心动过缓、高血压、心慌等；四、呼吸功能障碍，如呼吸困难等；五、循环功能障碍，如体位性低血压、下肢静脉血栓等；六、排便障碍，如尿潴留、尿失禁等；七、体温调节障碍，如高热等；八、性功能障碍和生育障碍，如勃起困难等；九、心理障碍，如焦虑、抑郁、绝望甚至轻生。

6-8周龄SD大鼠（280-320g）。

脊髓挫伤装置

本研究采用NYU撞击装置，原理是在一定高度，打击头在固定的轨道中自由落地挫伤脊髓，可通过改变不同的下落高度控制损伤程度

2.动物模型制作

采用3%戊巴比妥进行麻醉。然后在C5节段进行常规半侧椎板切除术以暴露脊髓。用自制椎夹固定C4-C6节段后连同脑立体定位仪平放于打击移动平台上，将2 mm直径圆柱形打击头对准C5节段的脊髓中线，打击头从硬脊膜表面升至距脊髓表面一定的高度20cm，然后驱动NYU打击器驱动向下打击脊髓，挫伤后迅速离开脊髓表面并上升。损伤后逐层缝合皮肤肌肉，肌注1万单位青霉素预防感染，之后把大鼠置于37°C恒温箱内1小时并注意观察呼吸和心率情况，后移至笼内常规饲养。

3.模型分析指标

（1）行为学观察

监测大鼠爬行时上肢大体和精细运动功能

（2） 电生理评估

分别采用SEP和MEP进行神经电生理评估

（3） 组织学观察

脊髓压迫后三个月，取材进行冰冻切片LFB染色观察

1. 行为学评估

损伤后的大鼠跟假手术组对比，损伤组都出现了明显的前肢运动功能障碍，随时间进展，出现不同的程度的功能改善。

图1 损伤组和对照组开场环境下运动功能评分（FLS）

2.电生理改变

脊髓损伤后SEP和MEP消失，在损伤后1周开始出现，但潜伏期延长，波幅降低，同时随着时间延长出现自发性的恢复，但到4周后到达平台期。

3.病理改变

LFB染色可见脊髓萎缩、组织结构疏松。组织内仍可见少量的出血，中央管扩张，另LFB染色可见压迫区轴突明显脱髓鞘改变

实验组脊髓灰质和白质明显损伤，组织出现多处空洞样改变，组织疏松。

该基因编辑小鼠将在屏障隔离环境（北京协和医院实验动物中心）内进行繁育、饲养及相关实验，其监督管理措施由动物中心负责。屏障隔离期间将保持清洁，保证其具有SPF级别清洁度，减少感染及发病几率。严格实验室管理，防止小鼠外泄，实验设计时将禁止其与野生型小鼠交配，保证编辑基因组序列不向自然界流通。上述措施将保证该动物模型的生物安全性，避免其影响生态环境。

该模型采用了CRISPR/Cas9技术，创新性地结合了人类遗传学与动物基因编辑技术，首次在小鼠上重构了与人类疾病类似的遗传模式，在Tbx6基因上同时引入无效突变和promotor区域的亚效等位基因，并将二者结合，形成复合杂合突变并获得相应的脊柱畸形表型。该模型是国际上首创的复合杂合突变脊柱畸形表型，对于解释先天性脊柱侧凸的分子机制和发病过程具有极高的研究讨论价值。